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氨基酸分离与鉴定--双向层析

氨基酸分离与鉴定--双向层析

实验原理

纸层析是以滤纸作支持物,用一定的溶剂系统展开,使混合样品达到分离分析的层析方法。其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中,点样在滤纸的一端;再选用适当的溶剂系统,从点样的一端通过毛细现象向另一端展开,展开完毕,取出滤纸晾干或烘干,再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经展开后某一物质在纸层析谱上的位置常用比移值Rf来表示。

纸层析可看作是溶质(样品)在固定相与流动相之间的连续抽提,由于溶质在两相之间的分配系数不同而达到分离。一定的物质在两相间有固定的分配系数,因而在恒定条件(液剂、PH、温度)下,各物质有固定的Rf值,据此可达到分析鉴定的目的。

由于滤纸纤维可吸收20~25%的水分;且其中6~7%以氢键形式与纤维素上羟基结合,一般条件下难脱去;所以纸层析实际上是以水相作固定相,展开的溶剂作流动相。

纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行、下行和径向三种。氨基酸分离一般用上行法。上行法又分单向(成分较为简单的样品)和双向(单向时斑点重叠分离不开,于是在其垂直方向用另一种溶剂系统展层)。双相层析谱可分辨十几种以上的样品。

层析溶剂要求:

(1)被分离物质在该溶剂系统中Rf在0.05~0.8之间,各组分之Rf值相差最好能大于0.05,以免斑点重叠。

(2)溶剂系统中任一组分与被分离物之间不能起化学反应。

(3)被分离物质在溶剂系统中的分配较恒定,不随温度而变化,且易迅速达到平衡,这样所得斑点较圆整。

本实验采用八种混合氨基酸为样品,用酸性和碱性两种溶剂进行双向层析,以茚三酮为显色剂,可获得分离清晰的层析图谱,如图3.2所示。

 

 

图3.2 八种混合氨基酸双向层析图谱

 试剂和器材

 一、试剂

0.1%(W/V)茚三酮丙酮液。

溶剂系统:第一相:正丁醇∶88%甲酸∶水=15∶3∶2(V/V);

第二相:正丁醇∶吡啶∶95%乙醇∶水=5∶1∶1∶1(V/V)。

二、测试样品

标准氨基酸混合溶液:亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸、组氨酸、丝氨酸各100mg溶于50mL 0.01M盐酸中。

三、器材

层析缸25×40cm(×2);培养皿15cm(×2);喷雾器;毛细管内径0.1cm;电吹风;烘箱。层析滤纸12×12cm;铅笔,尺。

操作方法

一、点样

取层析滤纸一张(12×12cm),在距纸边1.2cm处划一基线;再将纸转90°,距纸边1.2cm处作一线与上线垂直。以毛细管吸取混合氨基酸溶液,点与二线交点处(见图3.2),点的直径控制在2mm左右,不可过大。待样品干燥后再点一次。滤纸上点样斑点干燥后,把滤纸卷成圆筒形,纸的两边以铬丝相连,但不可重叠相碰。

二、展层

在层析缸中平稳的放入装有第一相层析溶剂的培养皿。将圆筒形滤纸放入,点样一段接触溶剂,以点样处不浸入溶剂为准。待溶剂自下而上均匀展开,约2小时后溶剂到达距纸边0.5cm处取出滤纸,悬挂于室温中,用电吹风充分吹尽溶剂。然后裁去未走过溶剂的滤纸边缘,将滤纸转90°,卷成如前圆筒状,放入盛第二相溶剂的层析缸内展开(操作同上,图3.3),约1小时后溶剂展开到距纸边0.5cm时取出,用电吹风吹尽溶剂使其干燥。

 

 

图3.3 纸层析点样、展层示意图

(X, Y分别为原点至斑点中心和溶剂前沿的距离,x为点样原点)

三、显色

用喷雾器将茚三酮均匀地喷在滤纸上,然后悬滤纸于65℃烘箱内,烘30分钟,即可看到紫红色氨基酸斑点,将图谱上的斑点用铅笔圈出。用直尺量出各斑点中心与原点的距离以及溶剂前沿与原点的距离,求出各氨基酸的Rf值。将各显色斑点的Rf值与标准氨基酸的Rf值比较,可得知该斑点的准确成分。

注意事项

(1)烘箱加热温度不可过高,且不可有氨的干扰,否则图谱背景会泛红。

(2)第一相溶剂最好在使用前再按比例混合,否则会引起酯化,影响层析效果。

(3)整个实验操作应戴手套进行。