蛋白质定量试剂盒Bradford法， 5X
K1022-2800次
描述：考马斯亮蓝蛋白定量法又称Bradford法，是最常用的蛋白质快速定量方法之一。考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue G-250)与蛋白质结合后染料的最大吸收峰由465nm变为595nm，溶液的颜色由棕色变为兰色，在595 nm波长下测定的吸光度值与蛋白含量成正比。灵敏度比Lowry法高4倍，与BCA法相当。反应迅速，2分钟达到平衡并在1小时内保持稳定。操作简便，只需要一种反应试剂。干扰物质少，K+、Na+、Mg2+离子、Tris、葡萄糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、(NH4)2SO4、乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。本试剂盒采用改良Bradford法和优化的试剂组成以及优化的测定方案，对0.5-4000 µg/ml浓度范围的蛋白进行线性检测，显著提高了蛋白检测灵敏度。提供5 ´ 染料浓缩液可进行400次标准2 ml比色杯检测，或2666次microplate检测。
组成与储存： 1) 5 ´ Coomassie浓缩溶液 100 ml; 室温或4ºC 1年;
2) 牛血清白蛋白标准品(BSA)：4.0 mg/ml溶液 1 ml。−20ºC保存。
所需设备：比色计或酶标仪、微板比色仪，工作波长为595 nm ± 5 nm (见说明1)。
溶液配制：
工作染液配制
用蒸馏水将5×Coomassie浓缩液稀释为500 ml 1×染料工作液。稀释的1×染料工作液用普通滤纸过滤除去沉淀，否则可能无法使用。1×染料工作液在4ºC避光保存9个月，放置后如由茶色变蓝色可再次过滤。加入反应管前应升到室温，直接使用4ºC工作液不影响精度但测得的OD值较低。
标准蛋白溶液配制
按照表-1和下页说明将标准牛血清白蛋白(BSA，4 mg/ml，-20ºC)稀释为需要的浓度。可用双蒸水、0.9%生理盐水、PBS、或使用待测蛋白样品的缓冲液稀释。
测定范围: (1) 标准方案50-2000 µg/ml; (2) 高敏感方案5-500 µg/ml; (3) 超敏感方案0.5-50 µg/ml。
标准测定：反应终体积2 ml。用1 cm光程玻璃或塑料比色皿，用比色计测定。
微量测定：反应终体积300 µl。用96孔微板，用酶标仪、微板比色仪测定。
标准曲线制作
取8支干净试管，按下表加样。将试管中溶液充分混匀，放置2 min。将溶液分别加入1 cm光径的比色皿(或取200 µl加入96孔微板)，用分光光度计、酶标仪、微板测量仪测定595 nm处的光吸收值OD595。用标准蛋白质浓度(mg/ml)为横座标，用吸光度值OD595为纵座标作图，即得标准曲线。
样品测定与浓度计算
样品测定方法同上(标准曲线制作)。根据标准曲线和测出的未知样品的OD595值，查出未知样品的蛋白质浓度。此浓度是与染料工作液混合之前的待测样品中的蛋白浓度。如果样品在与染料工作液混合之前经过稀释，最后估计样品蛋白浓度时须乘以实际稀释倍数。
表1 几种不同测定方案的加样量和比例
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测定方案 |
超敏感方案 |
高敏感方案 |
标准方案 |
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测定范围 |
0.5-50 µg/ml |
5-500 µg/ml |
50-2000 µg/ml |
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微量测定或标准测定 |
微量 |
标准 |
微量 |
标准 |
微量 |
标准 |
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检测管数 |
2666 |
400 |
1400 |
210 |
1400 |
200 |
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加入标准蛋白或待测蛋白样品溶液 µl |
150 |
1000 |
15 |
100 |
3 |
20 |
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精确加入考马斯亮蓝染料工作液 µl
或者为简便操作加入以下近似量µl |
150
|
1000 |
285
300 |
1900
2000 |
297
300 |
1980
2000 |
|
反应总体积 µl |
300 |
2000 |
300 |
2000 |
300 |
2000 |
|
标准或待测蛋白样品与考蓝工作液的比例 |
1:1 |
1:1 |
1:20 |
1:20 |
1:100 |
1:100 |
标准方案(50-2000 µg/ml)标准曲线的标准蛋白倍比稀释:
标准测定时：30 µl 4000 µg/ml BSA + 30 µl稀释溶液(H2O/PBS/0.9%NaCl) = 60 µl (BSA=2000 µg/ml)，取30 µl连续倍比稀释7次，得到BSA标准溶液2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 µg/ml。每一稀释度标准溶液各取20 µl，与1980 ml或者2000 ml染料工作液混合。
微量测定时：5 µl 4000 µg/ml BSA + 5 µl稀释溶液(H2O/PBS/0.9%NaCl) = 10 µl (BSA=2000 µg/ml)，取5 µl连续倍比稀释7次。得到BSA标准溶液2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 µg/ml。每一稀释度标准溶液各取3 µl，与297或300 ml蓝染料工作液混合。
高敏感方案(5-500 µg/ml)标准曲线的标准蛋白倍比稀释:
标准测定时：37.5 µl 4000 µg/ml BSA + 262.5 µl稀释溶液(H2O/PBS/0.9%NaCl) = 300 µl (BSA=500 µg/ml)，取150 µl连续倍比稀释7次。得到BSA标准溶液500、250、125、62.5、31.25、15.625 、7.813、3.906 µg/ml。每一稀释度标准溶液各取100 µl，与1800 ml或者2000 ml染料工作液混合。
微量测定时：3.75 µl 4000 µg/ml BSA + 26.25 µl稀释溶液(H2O/PBS/0.9%NaCl) = 30 µl (BSA=500 µg/ml)，取15 µl连续倍比稀释7次。得到BSA标准溶液500、250、125、62.5、31.25、15.625 、7.813、3.906 µg/ml。每一稀释度标准溶液各取15 µl，与285 ml或者300 ml染料工作液混合。
超敏感方案(0.5-50 µg/ml)标准曲线的标准蛋白倍比稀释
标准测定时：37.5 µl 4000 µg/ml BSA + 2962.5 µl稀释溶液(H2O/PBS/0.9%NaCl) = 2000 µl (BSA=50 µg/ml)，取1000 µl连续倍比稀释7次。得到BSA标准溶液50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391 µg/ml。每一稀释度标准溶液各取1000 µl，与1000 ml染料工作液混合。
微量测定时：3.75 µl 4000 µg/ml BSA + 296.25 µl稀释溶液(H2O/PBS/0.9%NaCl) = 300 µl (BSA=50 µg/ml)，取150 µl连续倍比稀释7次。得到BSA标准溶液50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391 µg/ml。每一稀释度标准溶液各取150 µl，与150 ml染料工作液混合。
注意事项
1. 分别在工作波长为595 nm和450 nm测定OD值，计算OD594/OD450，以此代替原有的OD595作图，可明显提高检测的精确度和灵敏度约10倍，显著提高测定的线性关系，并降低去垢剂的影响。在进行超敏感度测定时可考虑此法。
2. 主要干扰物质的终浓度：SDS<0.002%；Triton X-100<0.1%；Tween-20/60/80<0.015%；NaOH<0.1N。
3. 蛋白-染料结合物在1小时内保持稳定，但在5-20分钟内稳定性最好，因此应尽快测定。如果放置过久将出现沉淀，或使测定结果偏低。
4. 染料不结合精氨酸、赖氨酸及分子量小于3kDa的短肽，所以不同的蛋白质由于精氨酸和赖氨酸含量不同会出现小范围的测量偏差；小于3kDa的短肽纯品不能用此方法测定。
5. 染料-蛋白结合物附着在石英比色皿后难以洗去，因此不宜使用石英比色皿。可用玻璃或塑料比色皿，用后立即用95%乙醇或洗涤剂浸泡洗涤。塑料比色皿不可用乙醇长时间浸泡。
6. 标准曲线应该每次新做。但每一稀释度的BSA标准品可预先配好-20ºC冻存备用，注意在使用这种非新鲜配制的BSA时，如果发现标准曲线的某一些点偏差较大，说明稀释的BSA已经坏掉应予重配。
7. Bradford法物质干扰及耐受的最大浓度参见公司网站pdf文件。
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