膜/疏水蛋白与亲水蛋白双相分离系统
K1005-50ml
K1005-100ml
描述：真核组织30%以上的蛋白质为一次或多次跨膜蛋白如受体，分布于细胞膜和胞内各种质膜系统，而一些蛋白本身直接与脂质相连如脂蛋白。至少有70-80%的药物通过作用于这种膜/疏水蛋白而发挥作用。另外，许多蛋白在磷酸化、糖基化、烷基化时改变其亲水或疏水性质，由疏水趋于亲水或者由亲水趋于疏水，如蛋白转位并执行特定的功能。
膜/疏水蛋白与亲水蛋白双相分离系统(TansMem protein isolation system)提供快速简便的分离方案，在温度诱导下跨膜/疏水蛋白质选择性与亲水蛋白分离。真核组织、酵母细胞在非离子型去垢剂存在下裂解，冰上孵育10分钟；然后37度孵育30分钟，室温12000 rpm离心数分钟。溶液分为两相，亲水胞浆蛋白在上层水相，而跨膜蛋白和疏水蛋白质分布于下层相。由于下相体积极小，跨膜/疏水蛋白被选择性分离的同时也被高度(20倍以上)富集。整个过程不超过1小时。此试剂盒用于选择性分离膜/疏水蛋白与亲水蛋白、蛋白转位、2-D胶、Western Blot等研究。适用于动物、植物、细菌、酵母等各种组织。
适用：选择性分离跨膜/疏水蛋白与亲水蛋白、蛋白转位、2-D胶、Western Blot等。
规格： 50 assay, 25 ml Lysis buffer；50 ml Dilution buffer,
100 assay, 50 ml Lysis buffer；100 ml Dilution buffer,
One assay is sufficient for (1) 20-50 mg动物组织，(2) 0.05 ml 湿润的细胞沉淀，适于真核细胞、酵母、细菌，(3) 50~200 mg 植物组织。
保存：4 ºC
分离操作：
切记：预冷的Lysis和Dilution buffer是提取成功的关键。Lysis和Dilution buffer应储存于4°C，提取前应该仔细检查，溶液应该均匀透明，如果出现混浊应该将Lysis和Dilution buffer放在冰水浴15分钟，期间翻转瓶子数次使液体均匀冰冷。以下步骤按照推荐的温度操作绝对重要，不正确的温度将导致失败。可按比例加大或缩小提取规模。不足量的Lysis buffer将导致不充分裂解和低蛋白产率。
1. 在一小离心管内加入0.5 ml Lysis buffer，可用于裂解：(1) 20-50 mg动物组织。(2) 0.05 ml 湿润的细胞沉淀，真核细胞、酵母、细菌。(3) 200 mg 植物组织应先在液氮中研为粉末。但植物组织用量的上限变化甚大。某些新鲜植物组织含水量甚高，而较干燥的植物组织50mg可能已经接近上限。软组织、叶片、花、多汁组织、发芽种子等可直接加入Lysis Buffer研磨破碎，而坚硬的植物组织如种子、木质茎干等最好先在液氮中研磨破碎为粉末。
按下列方法之一裂解组织：(1) 玻璃匀浆器：放入剪碎组织，加入0.5 ml Lysis buffer，放置冰上，上下手动匀浆组织10-20次。应略微多加一些裂解液以补充裂解产物粘在器皿壁上造成的体积丢失。(2) 超声破碎仪：放入剪碎组织，加入0.5 ml Lysis buffer，放置冰上，每次超声30~40秒，共3~4次。(3) 内切式高速机械匀浆器：将组织放入塑料或玻璃试管内，试管置冰浴烧杯中，加入0.5 ml Lysis buffer，将内切式分散器头垂直插入管内溶液中间并与组织块接触，转速12,000-20,000 rpm，缓慢上下移动试管10-20次，直到大部分组织打散。适于大规模提取。(4)研钵：液氮冻存组织研成粉末，倒入加有0.5 ml Lysis buffer的离心管内，或可转移到玻璃匀浆器继续研磨。注意：用玻璃匀浆器和超声仪可能比液氮研磨方便。注意某些细胞类型需要更剧烈的破碎条件，如细菌比动物细胞难以破碎，一些坚硬的植物组织难以破碎，酵母破碎可能需要使用玻璃珠。
2. 将裂解组织液转移于小管，放冰水浴。加入等体积冰冷的Dilution buffer (0.5 ml)，总体积1ml。振荡3次，每次30秒，振荡间歇期间离心管放冰水浴。振荡完毕后离心管放冰水浴10分钟。
3. 12,000 rpm离心5分钟，4°C，将上清液转移到新管，弃沉淀。注意保持离心温度4°C。
4. 然后，将装有上清裂解液的小管置于37°C水浴，不时振荡3次，每次30秒。37°C孵育20 min，溶液分为两相。
5. 12,000 rpm离心5 min，30°C。离心温度必须至少大于25°C以上。
6. 离心后溶液必须分为两相，否则应在重复步骤4-5。上层水相含亲水性蛋白，下层油状相约50ml含有疏水性蛋白。取出上层水相转移到新管，此管为亲水性蛋白并做标号，−70°C保存。如果不需要亲水性蛋白也可以丢弃上层水相。两相中间或管底有碎片或沉淀，可去除之或不予理会。勿触动下层油状相，也可以将下层油状取出转移到新管中。
7. 加入0.5 ml冰冷的Dilution buffer与下层油状相混合，振荡3次，每次30秒。振荡间歇期间离心管放冰水浴。冰水浴10分钟。重复步骤4和5。继续尽可能完全地取出上层相，弃去。
8. 将含膜蛋白/疏水蛋白的油状下层相转移到新管，并做标号，分装，−70°C储存。
9. 后续处理。获得的上清液中的亲水性蛋白无需进一步处理，可直接进行蛋白定量，进行后续实验，例如与2~4 ´样品缓冲液混合进行2-D胶或SDS-PAGE电泳。
10. 获得的膜/疏水蛋白含有较高浓度的非离子型去垢剂。可按以下方法之一处理：(1) 加3-4倍体积浓缩的SDS样品缓冲液混合，加热变性，进行SDS-PAGE电泳。(2) 去除去垢剂并沉淀蛋白：加入9倍体积的预冷的丙酮或甲醇，−20°C 30min或过夜。12000 rpm 10 min at 4°C。弃上清，再次瞬时离心尽弃上清，干燥沉淀。可用蒸馏水、10 mM Tris-Cl pH7.0、或适宜的样品缓冲液溶解沉淀，如用2-D胶样品缓冲液重悬可进行2-D胶电泳。−70°C储存或进行后续试验如2-D胶或SDS-PAGE电泳。
11. 如果管底有沉淀，该沉淀包含膜的骨架成分，也可能含有少量不被抽提的膜蛋白，但主要的功能性膜/疏水蛋白并不在此沉淀中。如果需要检测所有的膜/疏水蛋白，用相应的样品缓冲液重悬此沉淀，高速离心数分钟，取上清，与前面获得的膜/疏水蛋白组分混合，上样电泳。
说明：
1. 膜蛋白/疏水蛋白含有较高浓度的非离子型去垢剂，应该进行适当稀释。含有非离子型去垢剂的样品SDS-PAGE电泳时小分子量蛋白条带易于变形，低电压或延长电泳时间(mini胶跑完全程>=3小时)有助于防止条带变形。
2. 通常丙酮沉淀后蛋白可能难于溶解，含SDS的buffer有助于溶解。
3. 应该将提取膜/疏水蛋白和亲水性蛋白同时上样电泳，进行比较分析。通常，亲水性蛋白不会或极少出现在膜/疏水蛋白组分中，但膜/疏水蛋白却可能会或多或少地出现于亲水性蛋白组分中。这种现象是由膜/疏水蛋白本身的特性决定的，因为膜/疏水蛋白的疏水性不是绝对的。因此，疏水程度决定蛋白在两种提取相的分布比例。了解这一知识有助于正确解释和理解实验结果。
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