核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒
H1017-50次
H1017-100次
一、描述
本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取核蛋白和/或胞质蛋白，提取制备过程简便。制备的核蛋白和胞浆蛋白能保持天然活性，并且纯度较高。提取的蛋白可用于进一步的转录因子活性分析、凝胶阻滞实验(gel shift assay)、免疫共沉淀、Western Blotting、酶活性测定等后续蛋白质研究。
二、试剂盒组份
|
组份 |
P1200 （50T） |
P1200 （100T） |
|
CEB- A |
25 mL |
50 mL |
|
CEB- B |
1.5 mL |
2×1.5 mL |
|
NEB |
5 mL |
10 mL |
三、保存条件：4℃
四、实验条件和参数
1. 所有的操作都应在冰浴中进行， 所有的试剂在实验前都要预冷；
2. PCV：细胞离心后的体积，该体积用于估计试剂加入的量，PCV因细胞类型不同而有所差异；
3. 下表是细胞数、PCV和加入试剂的对应关系，根据细胞类型的不同可根据实际情况进行相应的调整。
|
细胞数量 |
5 ×105 |
1 ×106 |
5 ×106 |
|
PCV(ml) |
5 |
10-20 |
60-100 |
|
CEB- A (ml) |
25 |
50-100 |
300-500 |
|
CEB- B (ml) |
1.2-1.5 |
3-6 |
3-6 |
|
NEB(ml) |
5-10 |
20 |
100 |
五、实验步骤
1. 材料的获得：（1）当贴壁细胞生长到70-90％时弃去培养基，用预冷的PBS 洗涤两遍，然后用1mL 预冷的PBS 刮下细胞转移至预冷的1.5mL 微量离心管中，4℃离心，800×g,5 min 收集细胞，用移液枪尽可能取去上清，勿留残液，估计细胞PCV（离心后的细胞体积）；（2）若是悬浮细胞则转入合适的预冷的离心管中，800×g,5 min 收集细胞，用预冷的PBS重悬洗涤细胞两次，4℃离心，800×g,5 min 收集细胞，用移液枪尽可能取去上清，勿留残液，估计细胞PCV；（3）如果是组织样本，将组织剪切成小块，加入适量的冰冷PBS洗涤两次， 800×g，5 min，弃上清，估计离心后的体积。科达宏伟
2. 加入5倍PCV体积的CEB- A（即50-100 ml的细胞加入250-500 ml的CEB- A）【可选步骤：使用前每mL CEB- A加入1μl DTT，5μL PMSF（用户自配：浓度100mM，溶于异丙醇)，5μL蛋白酶抑制剂】，涡旋混合仪剧烈振荡30s，放置冰上10～15min，并每隔5分钟在漩涡混合仪上振荡15秒；
3. 加入1/20体积的CEB-B，涡旋混合仪振荡10秒，放置冰上1min（此步可选：此步适宜于制备高纯度的核蛋白，但该步可能使少量的膜蛋白出现在胞浆蛋白中）；
4. 1000g 4℃离心5分钟，沉淀即是核粗提物，上清则是胞浆蛋白；
5. 尽快将上清转入另一预冷的洁净微量离心管，12000g 4℃离心取上清，即得胞质蛋白，加入20％的甘油于-20℃或-70℃保存；
6. 用100μl CEB- A洗涤沉淀，1000g 5min弃上清；
7. 在离心沉淀物（细胞核）中加入100μL预冷的NEB ( 可选：使用前每ml NEB 加入1μL DTT，5μLPMSF，5μl蛋白酶抑制剂)，最大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上30min，每间隔10 min涡旋剧烈振荡15 seconds；
8. 4℃离心，12000×g,,5min，尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管，即得核蛋白；
9. 上述提取的胞质蛋白和核蛋白进行蛋白定量（Braford法或BCA法）后分装并保存于-70℃，避免反复冻融。
说明：
1. 按照说明书操作，每106个细胞可得到50-75μg蛋白；
2. 该实验中裂解的时间是重要的，裂解时间过短则细胞裂解不完全，导致低的蛋白产率，裂解时间长则可能导致胞浆蛋白中有核蛋白的污染；
3. 细胞裂解因细胞类型而异。如果细胞难以裂解则可选用第3步，或者可以使细胞通过22号针头，重复三次，使得90％以上的细胞破碎；
4. 在得到的核蛋白中含有25％的甘油和420 mM的 NaCl；
5. 在该试剂盒中未加入蛋白酶抑制剂，用户在使用时可自行加入，本试剂盒在不加入蛋白酶抑制剂时仍可得到高浓度的蛋白。
| 
