描述：活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。活性氧检测试剂盒(Reactive oxygen species assay kit)采用DCFH-DA探针检测活性氧。DCFH-DA是迄今为止最常用、最灵敏的细胞内活性氧检探针。本身没有荧光的DCFH-DA可穿过细胞膜进入细胞，在胞内转化生成DCFH。在活性氧存在的条件下，DCFH被氧化生成荧光物质DCF，绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比。在激发波长502 nm，发射波长530 nm附近，使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测DCF 荧光，从而测定细胞内活性氧水平。
DCFH-DA活性氧检测系统本底低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便。需要荧光显微镜、荧光光度计、流式细胞仪等荧光检测设备。激发波长500 ± 15 nm，发射波长530 ± 20 nm，或者按照FITC荧光检测条件检测。
组成与储存：(1) 0.1 ml 10 mM DCFH-DA in DMSO，-20 ºC保存。(2) 1 ml活性氧阳性对照，4 ºC保存。用前1:1000~1:10,000倍稀释。
试剂准备：
1. 推荐DCFH-DA 1:1000稀释即初始工作浓度为10 µM。针对不同的细胞和刺激，DCFH-DA有效工作浓度可在100 nM~20 µM宽范围内变动，因此需要进行预试验确定合适的浓度。
2. DCFH-DA可稀释于培养基或缓冲液中。但如果培养基颜色或血清干扰荧光测定，需将DCFH-DA稀释于无酚红无血清培养基、或适宜的缓冲液如PBS中。这依赖于使用何种荧光设备进行测定。
3. 活性氧(2 mM H2O2)阳性对照的工作浓度约为100 µM，超过200µM将产生细胞毒。
细胞准备：贴壁或悬浮细胞常规培养。
加入荧光探针和荧光检测：
1. 用适宜的培养基或缓冲液洗涤细胞。直接加入DCFH-DA或将DCFH-DA稀释于培养基或缓冲液后再加入细胞。较小的体积能节省试剂。如果检测药物处理对细胞内活性氧的影响，药物Treat时间较短(2小时以内)或效应较弱的细胞，可先加或同时加入DCFH-DA。反之，treat刺激时间较长(6小时以内)或或效应较强的细胞，应该后加DCFH-DA。
2. 继续在CO2培养箱37 ºC孵育细胞30min~至几个小时。孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA浓度有关，需进行预试验确定。
3. 孵育结束后，洗涤细胞2~3次去除可能的细胞外荧光物质，降低背景。
4. 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜直接观察细胞，绿色荧光强度代表活性氧存在及浓度水平，进行荧光照相。或者收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪进行检测。激发波长488 (500 ± 15) nm附近，发射波长525 (530 ± 20) nm，或者按照FITC荧光检测条件，实时或逐时间点检测荧光强弱。科达宏伟
说明：
1. 细胞内的基础H2O2浓度范围为1-100 nM。
2. 血清或培养基颜色并不影响DCFH-DA及细胞内荧光产生，但可能会影响荧光显微镜观察，干扰荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪荧光测定。
3. 荧光强弱与与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA浓度和孵育时间长短有关，需进行预试验确定。
